|
|
Adaptation to adverse osmotic conditions as a tool for evolutionary enginnering of bacteria
Drotárová, Lenka ; Nováčková, Ivana (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the application of osmotic stress as a tool for evolutionary engineering of PHA producing bacterial strains. The aim of this thesis is to evaluate a bacterial adaptation to hypoosmotic environment, as an engineering tool in order to increase the production of PHA. The theoretical part focuses on the evolutionary engineering principle, methods of the strategy and the effect of physical factors on microorganism. The aim of experimental part was to performed an adaptive evolutionary experiment with the bacterial strain Halomonas halophila CCM 3662. Reduced osmotic pressure was used as a stressing factor during the serial cultivation. In order to generate PHA producing mutant strains, each passage was characterized using spectrophotometric and gravimetric method and by GC-FID. It was found that after the long-term cultivation, the mutant strain HH35, cultivated in 35 g/l NaCl, was associated with the highest biomass and PHB concentration. The 15th and 30th passages, along with the wild type strain H. halophila were subjected to further cell-robustness analysis with the application of hyper- and hypoosmotic shock. The stress response, viability of cells and morphological changes were analyzed using FC and TGA methods. Isolated polymers were characterized using FTIR analysis.
|
|
|
Využití Ramanovy spektroskopie a Ramanovské pinzety k analýze a isolaci PHA produkujících bakterií
Beránková, Barbora ; Enev, Vojtěch (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá studiem využití Ramanovy spektroskopie a Ramanovské pinzety k analýze a isolaci bakteriálních kmenů produkujících polyhydroxyalkanoáty (PHA). Pomocí plynové chromatografie s FID detekcí jsme stanovili obsah polyhydroxybutyrátu (P(3HB)) vbiomase PHA produkujících bakteriálních kmenů Burkholderia cepacia, Halomonas halophila, Cupriavidus necator H16 a jeho mutantního kmene Cupriavidus necatorH16/PHB–4 a dále Lactobacillus delbrueckii, která sice není producentem polyhydroxyalkanoátů, ale byla vybrána jakožto zástupce grampozitivních bakterií. Následně jsme díky Ramanově mikrospektroskopii, Ramanovské pinzetě a FT-IR spektrometru v kombinaci s Ramanovým FT-modulem dokázali potvrdit či vyvrátit přítomnost P(3HB) u bakterií. Dále práce popisuje bakterii Cupriavidus necator H16, která je modelovým organismem pro produkci P(3HB), a její mutantní kmen Cupriavidus necator H16/PHB–4. Bakteriální kmen Cupriavidus necator H16 byl kultivován v produkčním minerálním médiu o různém obsahu dusíku, a zároveň kultivace probíhala i v tekutém médiu Nutrient Broth, čímž byla připravena bakteriální biomasa s různým obsahem P(3HB), spektra se následně porovnávala se spektrem bakteriálního kmene Cupriavidus necator H16/PHB–4. Ramanova spektroskopie nachází dobré uplatnění při charakterizaci složení jednotlivých bakteriálních buněk, je rychlým, všestranným a prakticky neinvazivním nástrojem pro studium buněk.
|
|
|
Využití techniky AFM při studiu biologických vzorků
Khýrová, Markéta ; Smilek, Jiří (oponent) ; Slaninová, Eva (vedoucí práce)
Předmětem bakalářské práce bylo studium Gram-negativních bakterií se schopností akumulovat polyhydroxyalkanoáty pomocí mikroskopie atomárních sil. V rámci experimentální části práce byly zkoumány bakteriální kmeny Cupriavidus necator H16 a jeho mutantní kmen Cupriavidus necator PHB-4, Rhodospirillum rubrum a Halomonas halophila. Konkrétním cílem bylo optimalizovat tuto mikroskopickou metodu pro výzkum jak bakterií na vzduchu, tak živých bakterií v jejich přirozeném prostředí. Optimalizace byla provedena s ohledem na jednoduchost, časovou náročnost a reprodukovatelnost provedení měření. Pro měření na vzduchu byla zvolena imobilizace 10× zředěné bakteriální suspenze vysušením na skleněném substrátu. Skenování bylo provedeno pomocí hrotu TESPA-V2 se sníženou konstantou tuhosti v QITM módu. V rámci měření bakteriálních vzorků v kapalině byly zkoumány různé postupy imobilizace bakterií na skleněném substrátu pomocí Poly-L-lysinu a Poly(ethyleniminu). Jako nejvhodnější fixace byla zvolena metoda s využitím Poly-L-lysinu. Pro měření v QITM módu v kapalném prostředí byly voleny hroty MLCT – A nebo SNL – B s konstantou tuhosti okolo 0,1 N/m. Nakonec byl proveden pokus o zisk informací o adhezi a Youngově modulu vysušených i živých bakterií s ohledem na předpokládané ovlivnění mechanických vlastností buněk s rozdílným obsahem polyhydroxybutyrátu u bakteriálních kmenů Cupriavidus necator H16 a Cupriavidus necator PHB-4.
|
|
|
Vývoj minibioreaktoru pro mikrobiální biotechnologie
Jakešová, Michaela ; Szotkowski, Martin (oponent) ; Krejčí,, Jan (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce se zabývá vývojem minibioreaktoru pro mikrobiální biotechnologie. Výchozí jednotkou nového zařízení byl systém AlgaTox – analytický fotobioreaktor firmy BVT Technologies. Pracovní objem nového minibioreaktoru se pohybuje v rozmezí 4 až 8 ml. Minibioreaktor byl sestaven z minitermostatu, reakční nádoby, kyslíkové elektrody, teplotní a pH sondy, příslušenství pro přívod vzduchu do kapaliny a vsuvky pro transport kapaliny z/do reaktoru. Byla ověřena funkčnost sestaveného zařízení a proměřeny jeho charakteristiky. Dále byl pro vyvíjené zařízení zpracován operační postup dekontaminačního procesu využitím mlhy peroxidu vodíku. Rovněž byl sestaven operační postup pro kultivace mikroorganismů v minibioreaktoru. V připraveném zařízení byly provedeny pilotní kultivace bakterie Halomonas halophila. Při těchto kultivacích byly otestovány tři sestavy pro přívod vzduchu do kapaliny. Žádná ze sestav však nebyla schopna zajistit buněčné kultuře dostatečný přísun kyslíku – hodnota rozpuštěného kyslíku vždy klesla na 0 %. Pro následující vývoj byla navržena nová sestava pro přívod vzduchu do kapaliny – aerační věnec z membránové trubice.
|
|
|
Isolace PHA z bakteriální biomasy a jejich purifikace
Zlochová, Barbora ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá isolací a charakterizací bakteriálního polymeru PHA isolovaného z bakteriálního kmene Halomonas halophila (CCM 3662) osmošokem v destilované vodě, tedy hypošoku, kdy buňky popraskají a uvolní se PHA. Přidáním biosurfaktantů se současně solubilizují proteiny a lipidy zbytkové biomasy, čímž se teoreticky dosáhne čistějšího produktu PHB bez použití toxických látek jako například chloroformu. Teoretická část práce se zaměřuje na PHA z hlediska jejich obecných vlastností a využití, na mechanismus syntézy mikroorganismy PHA a jejich následné degradace a na existující strategie isolace PHA z bakteriální biomasy. V experimentální časti je popsaná produkce PHB bakterií Halomonas halophila pro celkem tři kultivace a následný proces isolace vzniklého PHB hypošokem halofilních bakterií v destilované vodě s přídavkem vybraných biosurfaktantů. Biosurfaktanty využívané v rámci práce jsou kokosové mýdlo, lecithin, rhamnolipidy, sophorolipidy, coco glukosid, lauryl glukosid a cocoamidopropyl betain. Vlastnosti isolovaného materiálu PHB byly analyzovány pomoci plynové chromatografie s FID detekcí a metodami SEC-MALS a FTIR. Na základě výsledků jsme za nejvhodnější biosurfaktanty, které se dají využít k isolaci PHB z bakteriální biomasy, zvolili dvojici coco glukosid a lauryl glukosid. V kombinaci s promytím materiálu ethanolem jsme při koncentraci biosurfaktantu 5 g/l a teplotě isolace 70 °C byli schopni dosáhnout čistoty 90 % při použití coco glukosidu a 89% čistoty při použití lauryl glukosidu.
|
|
|
Use of microcalorimetric techniques in the study of stress adaptation of microorganisms
Korfantová, Stanislava ; Slaninová, Eva (oponent) ; Krouská, Jitka (vedoucí práce)
This bachelor thesis uses microcalorimetric techniques to study stress adaptation of wild strain of H. halophila and H. halophila strain adapted to lower salinity of medium in the environment of levulinic acid, which occurs naturally in hydrolysates of lignocellulosic materials. These can serve as inexpensive substrates on which H. halophila is capable of producing polyhydroxybutyrate. Microcalorimetric measurements showed that the wild-type H. halophila strain could adapt to levulinic acid to a concentration of 5 g/l. The adapted strain, which was assumed to have poorer stress management based on lower PHB yields, could adapt to all observed concentrations. The results were compared with a conventional method that confirmed the results of microcalorimetry. Microcalorimetry has been evaluated as a universal and susceptible method that is suitable for studying the metabolic activity of microorganisms. To better interpret the obtained microcalorimetric results, it is necessary to supplement the technique with information from other analytical techniques. The bachelor thesis uses spectrophotometric and gravimetric determination and gas chromatography with a flame ionization detector to characterize the wild and adapted strain before monitoring the adaptation to levulinic acid. The techniques offered enriching information to supplement the microcalorimetry outputs.
|
|
|
Evolutionary engineering of PHA producing bacterium Halomonas halophila
Ikrényiová, Terézia ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with evolutionary engineering of PHA producing bacteria, the principle of PHA production and solution of this production’s disadvantages, but also applications of these biopolymers in the theoretical part. The production of polyhydroxyalkanoates by bacteria Halomonas halophila, which is focused on gaining the maximus amount of 3-hydroxyvalerate in formed copolymer, is described in the experimental part. The precursor valeric acid was added to bacteria due to gain the amount of 3HV. It was found that the concentrations over 3 g/l aren´t usable for production sufficient concentration of PHA. The very low concentrations of valeric acid led to low amount of 3HV in PHA. The available concentration of this precursor for production sufficient concentration of PHA by bacterial cell is 3 g/l. Moreover, it was found that the valeric acid should be added after 24 hours of cultivation in mineral production medium. The thesis is also concentred on comparison the original bacterial strains of Halomonas halophila to strains, which were adapted on valeric acid as stress factor for bacteria. The assumption, that the adapted strains can better utilize valeric acid and the incorporation to copolymer of it is higher like the original strains, was affirmed.
|
|
|
Utilization of thermal analysis in the study on effects of microbial inhibitors
Bošeľová, Miriam ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Sedláček, Petr (vedoucí práce)
This diploma thesis deals with the use of thermal analysis in the study on effects of microbial inhibitors. The main aim of this work was to determine the utilization of the method, which is mainly used in different fields of science and research. Three bacterial strains: Cupriavidus necator H16, its mutant strain Cupriavidus necator PHB-4 and Halomonas halophila, were used as model microorganisms. The inhibitory effect of levulinic acid on growth and metabolic activity was monitored by microcalorimetry. It was found that bacteria were able to adapt to levulinic acid to a certain concentration - Cupriavidus necator to 5 g/l and Halomonas halophila to 2 g/l. The thermal analysis results were compared to a conventional method, which is commonly used to study the growth of microorganisms.
|
|
|
Biotechnologická produkce PHA z odpadních otrub
Guziurová, Pavlína ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá biotechnologickou produkcí polyhydroxyalkanoátů (PHA) z odpadních pšeničných otrub. Cílem bylo zjistit, zda hydrolyzát z pšeničných otrub podrobený různým typům předúpravy lze využít jako substrát pro produkci PHA pomocí vybraných bakteriálních kmenů. Vybrané kmeny byly Halomonas organivorans, Halomonas halophila a dva kmeny Schlegelella thermodepolymerans. Za nejlepší producenty byly vybrány halofilní kmeny, se kterými byly následně provedeny další kultivace. Nejefektivněji byly bakteriemi využity hydrolyzáty po neutrální předúpravě, jelikož měly nejnižší obsah mikrobiálních inhibitorů (fenolických látek), a bakterie na nich produkovaly nejvíce PHA. Nejvyšší hodnota naprodukovaného PHA bylo na hydrolyzátu s neutrální předúpravou u kmene Halomonas organivorans, konkrétně 2,82 g/l. Hydrolyzát byl využit i pro produkci kyseliny mléčné, pro kterou byly využity bakteriální kmeny Lactobacillus. Nejvyšší dosažená koncentrace naprodukované kyseliny mléčné byla 16,73 g/l u kmene Lactobacillus casei.
|
|
|
Utilisation of fluorescence techniques for analysis of industrially relevant microorganisms
Müllerová, Lucie ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Krčma, František (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Single-cell analysis techniques are very important when studying relevant biotechnological microorganisms. In biotechnological processes, the optimum is to have fast, efficient and real-time analyses that can be done with minimal preparations. Therefore, we looked at autofluorescence as a possible and natural marker when employing fluorescence microscopy and flow cytometry. First, it has been established, based on the emission spectra, that the green autofluorescence of the bacteria used – Cupriavidus necator H16 and its non polyhydroxyalkanoates (PHA) producing mutant Cupriavidus necator PHB-4, is caused predominantly by flavins. The maxima of emission spectra were 510 – 550 nm for FAD, FMN and riboflavin whose spectra could not be distinguished, and 515 nm for both strains of Cupriavidus necator. Two maxima of excitation spectra of the bacteria were found – one in the range 360 – 370 nm and another around 440 nm, and so a new protocol for fluorescence microscopy has been established - the laser used was 467 nm and the emission filter chosen for the detection was 520/35 nm. Flavins and their autofluorescence can also be used in combination with other fluorophores when the need for multi-parametrical analyses arises, but it’s highly recommended the other dyes emit other than green fluorescence in the band of 500 – 550 nm or/and have an average fluorescence lifetime other than 3.2 – 3.7 and 4.2 - 4.9 ns. These values stayed constant even when the cells were exposed to various cultivation and even stress conditions. That makes them a very stable marker compared to the dynamic marker of fluorescence intensity that changes immediately after a change in the environment. A new staining protocol for C. necator using PHA-specific hydrophobic probe BODIPY 493/503 was optimised. The optimal staining concentration of the lipophilic dye BODIPY 493/503 was determined to be 2.5 µg ml-1 and it can be used in combination with propidium iodide. The BODIPY 493/503 staining protocol has been used when analysing the morphology of the PHA-synthesising bacteria Halomonas halophila. Further, to study the UV-protective properties of PHA in Cupriavidus necator, another staining essay has been optimised. It has been established that the ROS sensitive dye CM-H2DCFDA gives better performance than its non-methylated form. Also, the UV-protective characteristics of the PHA-synthesising strain Cupriavidus necator H16 were confirmed when compared to its non-PHA synthesising strain C. necator PHB-4.
|
host ::
RSS.